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Métodos de identificación de las enfermedades infecciosas basados en ácidos nucleicos

Por Kevin C. Hazen, PhD, Professor of Pathology and Director of Clinical Microbiology, Duke University Health System

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La identificación molecular es cada vez más común en el diagnóstico clínico; la identificación rápida resultante permite que el paciente reciba la terapia antimicrobiana específica y evita el tratamiento prolongado con fármacos empíricos, potencialmente inadecuados. Los métodos basados en ácidos nucleicos detectan secuencias de DNA o RNA específicas, extraídas del microorganismo. Las secuencias pueden o no amplificarse in vitro.

Por lo general, los métodos basados en los ácidos nucleicos son específicos y muy sensibles, y pueden usarse para todas las categorías de microorganismos. Los resultados se obtienen con rapidez. Dado que cada prueba es específica para un solo microorganismo, el médico debe conocer los posibles diagnósticos y solicitar los análisis de acuerdo con ellos. Por ejemplo, si un paciente presenta síntomas que apuntan a una influenza pero la estación de ésta ya ha pasado, es mejor realizar una prueba de diagnóstico viral más general (p. ej., un cultivo viral) que una prueba específica para la influenza, ya que las causas podrían ser otros virus (como el parainfluenza o los adenovirus). Los avances recientes han conducido al desarrollo de ensayos multiplex, en los cuales un solo ensayo basado en ácidos nucleicos puede detectar y diferenciar entre ≥ 2 microorganismos causantes. Ensayos multiplex suelen ser menos sensiblesque los ensayos cualitativos de un solo objetivo.

Las pruebas basadas en los ácidos nucleicos son cualitativas, pero existen pruebas cuantitativas para un creciente número de infecciones (HIV, citomegalovirus, virus linfotrópico T humano); estos métodos pueden ser útiles para el diagnóstico y el seguimiento de la respuesta al tratamiento.

Las técnicas que identifican una secuencia de ácidos nucleicos pero que no requieren la amplificación de esas secuencias suelen estar restringidas a situaciones en las cuales el microorganismo se ha cultivado antes, o está presente en elevadas concentraciones en la muestra (p. ej., en una faringitis causada por Streptococcus del grupo A , en infecciones genitales causadas por Chlamydia trachomatis o Neisseria gonorrhoeae).

Amplificación

Las técnicas de amplificación de los ácidos nucleicos emplean cantidades muy pequeñas de DNA o RNA y las replican muchas veces, lo que permite entonces detectar microorganismos en cantidad de trazas en una muestra y evita la necesidad de realizar un cultivo. Estas técnicas son especialmente útiles para microorganismos que son difíciles de cultivar o de identificar con otros métodos (como virus, patógenos intracelulares obligados, hongos, micobacterias, algunas otras bacterias) o que están presentes en pequeña cantidad.

Estas pruebas pueden incluir la amplificación de una secuencia blanco (PCR, PCR con retrotranscriptasa o RT-PCR, amplificación de desplazamiento de cadena, amplificación de la transcripción), la amplificación de señales (ensayos de DNA ramificado, captura híbrida), la amplificación de sondas (reacción en cadena de la ligasa, uso de enzimas de escisión, sondas de ciclado) o el análisis posamplificación (secuenciación del producto amplificado, análisis de micromatrices y análisis de la curva de disociación, como en la PCR en tiempo real).

Son muy importantes la obtención adecuada de la muestra y su almacenamiento antes de llegar al laboratorio de diagnóstico molecular. Dado que los métodos de amplificación son tan sensibles, pueden producirse fácilmente resultados falsos positivos debido a contaminantes en trazas de la muestra o de los equipos. A pesar de esta elevada sensibilidad, a veces se producen resultados falsos negativos, incluso cuando el paciente es sintomático (p. ej., en la infección por el virus del Nilo occidental). Los resultados falsos negativos pueden minimizarse tomando algunas medidas:

  • Evitar el uso de hisopos con mangos de madera o puntas de algodón (debe usarse el hisopo que se ha validado para el ensayo de amplificación)

  • Transportar las muestras rápidamente

  • Congelar o refrigerar las muestras si su transporte tomará > 2 h

La congelación es el método de almacenamiento típico de las muestras para ensayos de amplificación de los ácidos nucleicos. Sin embargo, debe preferirse la refrigeración en lugar de la congelación si se sospecha la presencia de virus lábiles (como varicela-zóster, influenza o HIV-2) o si además van a realizarse cultivos virales (las muestras congeladas pueden no ser útiles para los cultivos estandarizados).