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Microscopia

Por Kevin C. Hazen, PhD, Professor of Pathology and Director of Clinical Microbiology, Duke University Health System

Información:
para pacientes

La observación microscópica puede hacerse rápidamente, pero su precisión depende de la experiencia del analista y la calidad del equipo utilizado. A menudo, la legislación limita el uso del microscopio por parte del médico para fines diagnósticos fuera de un laboratorio certificado. Puede ser necesario el examen microscópico del tejido para distinguir la enfermedad invasiva de la colonización superficial, una distinción que no se logra fácilmente mediante métodos de cultivo.

La mayoría de las muestras se tratan con tinciones que colorean a los microorganismos, destacándolos así del fondo, aunque pueden usarse muestras frescas sin tinción para detectar hongos, parásitos (entre ellos, huevos y larvas de helmintos), células vaginales o microorganismos móviles (p. ej., Trichomonas) y sífilis (mediante microscopia de campo oscuro). La visualización de los hongos puede incrementarse aplicando una solución de hidróxido de potasio (KOH) al 10% para disolver los tejidos circundantes y los microorganismos no micóticos.

El médico debe pedir una tinción de acuerdo con el patógeno que sospecha, pero ninguna es un 100% específica. La mayoría de las muestras se tratan con una tinción de Gram, y si se sospecha la presencia de micobacterias, con una acidorresistente (tinción de Ziehl-Neelsen). Sin embargo, algunos patógenos no se observan fácilmente con estas técnicas; si se sospecha su presencia, se requieren otras tinciones u otros métodos de identificación. Como la detección microscópica en general requiere una concentración de microorganismos de al menos aproximadamente 1 × 104-5/mL, la mayoría de las muestras de líquidos (como LCR) deben concentrarse (p. ej., por centrifugación) antes de ser observadas.

Tinción de Gram

La tinción de Gram clasifica a las bacterias de acuerdo con si son capaces de retener el colorante cristal violeta (grampositivas se ven de color azul) o no (gramnegativas se ven rojas) y destaca la morfología de las células (se observa si son bacilos o cocos) y su ordenamiento (en grupos, cadenas, diploides). Estas características pueden dirigir la elección de los antibióticos mientras se realiza su identificación definitiva. Encontrar una mezcla de microorganismos con múltiples morfologías y características de tinción con la técnica de Gram sugiere una infección bacteriana polimicrobiana. Para realizar una tinción de Gram, los técnicos fijan el material de la muestra con calor a un portaobjetos, y lo tiñen mediante la exposición secuencial al colorante de Gram cristal violeta, yodo, decolorante y un contracolorante (por lo general, safranina).

Tinciones acidorresistentes tradicionales y moderadas (modificadas)

Estas tinciones se usan para identificar microorganismos acidorresistentes (género Mycobacterium) y acidorresistentes moderados (principalmente, género Nocardia). También son útiles para teñir el Rhodococcus y los géneros relacionados, así como los ovoquistes del algunos parásitos (como Cryptosporidium).

Aunque la detección de micobacterias en el esputo requiere de al menos 10.000 microorganismos/mL, las micobacterias suelen estar en cantidades menores, por lo que su sensibilidad es limitada. En general, se usan varios mL de esputo que se descontaminan con hidróxido de sodio y se concentran por centrifugación para una tinción de este tipo. La especificidad mejora, aunque algunos microorganismos moderadamente acidorresistentes son difíciles de distinguir de las micobacterias.

Tinciones fluorescentes

Estas tinciones permiten la detección con menores concentraciones (< 1 × 104 células/mL). Algunos ejemplos son el naranja de acridina (para bacterias y hongos), la auramina-rodamina y la auramina O (para micobacterias) y el blanco de calcoflúor (hongos, especialmente dermatofitos).

En teoría, el acoplamiento de un colorante fluorescente con un anticuerpo dirigido contra el patógeno (inmunofluorescencia directa o indirecta) debe aumentar la sensibilidad y la especificidad. Sin embargo, estas pruebas son difíciles de leer e interpretar, y pocas se encuentran disponibles comercialmente y se usan con frecuencia (p. ej., las pruebas de anticuerpos fluorescentes directos para Pneumocystis y Legionella).

Tinción con tinta china (carbón coloidal)

Esta tinción se usa principalmente para detectar Cryptococcus neoformans y otros hongos encapsulados en una suspensión de células (p. ej., en una suspensión de LCR). Se tiñe el fondo del campo, en lugar del microorganismo en sí mismo, lo que hace que las cápsulas que rodean a los patógenos se vean como un halo. En el LCR, la prueba no es tan sensible como la detección de antígenos del criptococo. La especificidad también es limitada; los leucocitos pueden parecer encapsulados.

Tinción de Warthin-Starry y tinción de Dieterle

Estas tinciones argénticas se utilizan para visualizar bacterias tales como espiroquetas, Helicobacter pylori, microsporidios y Bartonella henselae (la causa de la enfermedad por arañazo de gato).

Tinción de Wright y tinción de Giemsa

Estas tinciones se usan para la detección de parásitos en la sangre, Histoplasma capsulatum en los fagocitos y células tisulares, inclusiones intracelulares formadas por virus o clamidias, trofozoítos de Pneumocystis jirovecii y algunas bacterias intracelulares.

Tinción tricrómica (tinción de Gomori-Wheatley) y tinción de hierro-hematoxilina

Estas tinciones se utilizan para detectar protozoos intestinales.

La tinción de Gomori-Wheatley se usa para detectar microsporidios. Puede ser incapaz de detectar la presencia de huevos de helmintos y no identifica al Cryptosporidium en forma fiable. Los hongos y las células humanas se tiñen.

La técnica con hierro y hematoxilina tiñe en forma diferencial células, inclusiones celulares y núcleos. Los huevos de helmintos pueden adquirir un color tan oscuro que no permita su identificación.