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Méthodes basées sur les acides nucléiques d'identification des maladies infectieuses

Par Kevin C. Hazen, PhD, Duke University Health System

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L'identification moléculaire est de plus en plus utilisée en clinique; l'identification rapide qui en résulte permet au patient d'être placé sous un traitement antimicrobien spécifique et d'éviter les traitements empiriques prolongés par des médicaments potentiellement inappropriés. Les méthodes génotypiques détectent les séquences d'ADN ou d'ARN extraites du micro-organisme et spécifiques de ce micro-organisme. Les séquences peuvent ou non être amplifiées in vitro.

Les méthodes basées sur les acides nucléiques sont généralement spécifiques et très sensibles et peuvent être utilisées pour toutes les catégories de microbes. Les résultats sont obtenus rapidement. Comme chaque test est spécifique d'un seul micro-organisme, le médecin doit envisager les diagnostics possibles et orienter sa prescription en conséquence. Par exemple, si un patient a des symptômes évoquant une grippe mais que la saison grippale est terminée, pratiquer un autre test de diagnostic viral plus général (p. ex., culture virale) plutôt qu'un test de la grippe soit préférable parce qu'un autre virus (p. ex., para-influenza, adénovirus) peut être en cause. Des progrès récents ont permis le développement de dosages multiplex, dans lequel un test à base d'acide nucléique unique permet de différencier les deux micro-organismes ≥ en cause. Les tests multiples sont généralement moins sensibles que les tests qualitatifs, à cible unique

Ces techniques sont qualitatives, mais il existe des méthodes quantitatives pour un nombre limité d'infections (p. ex., VIH, cytomégalovirus, human T-cell lymphotropic virus); ces méthodes peuvent être utiles en diagnostic et pour surveiller la réponse au traitement.

Des techniques qui ciblent des séquences d'acides nucléiques mais qui ne nécessitent pas d'amplification de ces séquences sont généralement adaptées aux situations dans lesquelles les micro-organismes ont été d'abord mis en culture ou sont présents à de fortes concentrations dans le prélèvement (p. ex., pharyngite due à Streptococcus du groupe A, infections génitales dues à Chlamydia trachomatis et Neisseria gonorrhoeae).

Amplification

Les techniques d’amplification des acides nucléiques utilisent l’extraction d’infimes quantités d’ADN ou d’ARN et les répliquent de très nombreuses fois, permettant ainsi de détecter des traces minimes d’un micro-organisme dans un prélèvement, sans avoir à recourir à une culture. Ces techniques sont particulièrement utiles pour les micro-organismes difficiles à cultiver ou à identifier par d'autres méthodes (p. ex., virus, pathogènes intracellulaires obligatoires, champignons, mycobactéries, certaines autres bactéries) ou présents en petite quantité.

Ces tests peuvent nécessiter l'amplification de la cible (p. ex., PCR, reverse transcriptase-PCR [RT-PCR], amplification par déplacement de brins, amplification de la transcription), amplification du signal (p. ex., dosage d'ADN branché, capture hybride), amplification de la sonde (p. ex., réaction en chaîne par ligase, technique de clivage invasif, technique de la cycling probe) ou analyse post-amplification (p. ex., séquençage du produit amplifié, puces à ADN [micro-arrays] et analyse de la courbe de fusion au moyen d'une PCR en temps réel).

Un prélèvement et un stockage appropriés avant l'arrivée au laboratoire de diagnostic moléculaire sont essentiels. Comme les méthodes d'amplification sont très sensibles, des faux positifs par contamination des prélèvements ou des équipements sont possibles. En dépit d'une grande sensibilité, des résultats faussement négatifs sont possibles même si le patient est symptomatique (p. ex., infection par le virus West Nile [virus du Nil occidental]). Les résultats faux négatifs peuvent être minimisés

  • En évitant l'utilisation d'écouvillons en bois ou de cotons tiges (le tampon qui a été validé pour le test d'amplification doit être utilisé)

  • Par le transport rapide des prélèvements

  • La congélation réfrigération des prélèvements si le transport est susceptible de durer > 2 h

La congélation est la méthode de stockage typique pour les tests d'amplification génomiques. Cependant, les prélèvements doivent être réfrigérés plutôt que congelés si des virus labiles (p. ex., le virus varicelle-zona, le virus influenza, le VIH-2) sont suspectés ou si des cultures virales sont également prévues (les prélèvements congelés peuvent ne pas être utilisables pour les cultures standards).