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Microscopie

Par Kevin C. Hazen, PhD, Professor of Pathology and Director of Clinical Microbiology, Duke University Health System

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La microscopie est une technique rapide, mais sa fiabilité dépend de l'expérience du technicien et de la qualité de l'équipement. La réglementation réserve souvent l'utilisation du microscope à visée diagnostique aux laboratoires agréés. L'examen microscopique des tissus peut être nécessaire pour distinguer la maladie invasive d'une colonisation de surface; une distinction qui n'est pas aisément obtenue par les cultures.

La plupart des prélèvements nécessitent une coloration qui met en évidence les microrganismes pathogènes; bien qu’un montage humide sous hydroxyde de potassium non coloré permette de détecter des champignons, des parasites (dont les œufs et larves d’helminthes), des cellules vaginales à inclusion et des microrganismes mobiles (p. ex., Trichomonas) et la syphilis (spirochètes Treponema, par microscopie à fond noir). La mise en évidence des champignons peut être accrue par l’application de d’hydroxyde de potassium à 10% (KOH) pour dissoudre les tissus environnants et les microrganismes non fongiques.

Le médecin choisit une coloration en fonction des microrganismes pathogènes potentiellement présents, bien qu’aucune coloration ne soit spécifique à 100%. La plupart des prélèvements sont traités par coloration de Gram et, en cas de suspicion de mycobactéries, par coloration spécifique acido-résistante. Cependant, certains pathogènes ne sont pas bien visibles avec ces colorations; si de tels agents pathogènes sont suspectés, des méthodes différentes d'identification ou de coloration sont nécessaires. La détection par microscope nécessite habituellement une concentration d'agent d'environ au moins 1 × 104-5/mL, la plupart des liquides biologiques (p. ex., le LCR) sont concentrés (p. ex., par centrifugation) avant l'examen.

Coloration de Gram

La coloration de Gram fait ce qui suit:

  • Classe les bactéries selon leur capacité à retenir la coloration par le cristal violet (Gram positif, couleur bleue) ou non (Gram négatif, couleur rouge)

  • Permet l’étude de la morphologie de la cellule (p. ex., bacilles ou cocci) et du type de regroupement (p. ex., amas, chaînettes, diploïdes)

Ces caractéristiques peuvent orienter le traitement antibiotique en attendant l'identification définitive. Trouver un mélange de microrganismes avec de multiples morphologies et caractéristiques de coloration au Gram évoque un échantillon contaminé ou une infection bactérienne polymicrobienne.

Pour effectuer une coloration de Gram, le prélèvement est fixé par la chaleur sur une lame de verre et coloré par exposition séquentielle au cristal violet de Gram, à l'iode, à un décolorant et à une coloration de contraste (en général de la safranine).

Colorations acido-résistante et acido-résistante modifiée

Ces colorations sont utilisées pour identifier ce qui suit:

  • Microrganismes acido-résistants (Mycobacterium sp)

  • Microrganismes modérément acido-résistants (principalement Nocardia sp)

  • Rhodococcus et genres apparentés

  • Les oocystes de certains parasites (p. ex., Cryptosporidium, Cystoisospora [Isospora] belli)

Bien que la détection des mycobactéries dans les crachats requière au moins 10 000 microrganismes/mL, les mycobactéries sont souvent présentes à des taux moins élevés et la sensibilité du test est donc limitée. Habituellement, plusieurs mL d'expectorations sont décontaminés avec de l'hydroxyde de Na (soude caustique) et concentrés par centrifugation en vue d'une coloration acido-résistante. Sa spécificité est en revanche meilleure, bien que certains microrganismes modérément acido-résistants soient difficiles à distinguer des mycobactéries.

Colorations fluorescentes

Elles permettent une détection de souches à des concentrations plus faibles (< 1 × 104 cellules/mL). Les exemples en sont

  • Acridine orange (bactéries et champignons)

  • Auramine-rhodamine et auramine O (mycobactéries)

  • Calcofluor blanc (champignons, en particulier dermatophytes)

Le couplage d'un marqueur fluorescent à un Ac spécifique d'un pathogène (immunofluorescence directe ou indirecte) doit en théorie permettre d'augmenter la sensibilité et la spécificité du test. Ces tests sont cependant difficiles à lire et à interpréter et peu d'entre eux (p. ex., tests par Ac fluorescents directs pour Pneumocystis et Legionella) sont disponibles dans le commerce ou utilisés en routine.

Coloration à l'encre de Chine (carbone colloïdal)

Elle est utilisée principalement pour détecter Cryptococcus neoformans ou d'autres champignons encapsulés dans une suspension cellulaire (p. ex., culot de sédimentation du LCR). Le fond et non le microrganisme lui-même, est coloré, ce qui révèle la capsule sous forme d'un halo. Dans le LCR, ce test n'est pas aussi sensible que la recherche d'Ag solubles cryptococciques. La spécificité est également limitée; les GB peuvent apparaître encapsulés.

Coloration de Warthin-Starry et de Dieterle

Ces colorations couleur argent sont utilisées pour visualiser des bactéries telles que

  • Spirochètes

  • Helicobacter pylori

  • Microsporidies

  • Bartonella henselae (la cause de la maladie des griffes du chat)

Coloration de Wright et de Giemsa

Ces colorations sont utilisées pour détecter ce qui suit:

  • Parasites dans le sang

  • Histoplasma capsulatum dans les phagocytes et les cellules tissulaires

  • Les inclusions intracellulaires formées par les virus et l'infection à chlamydia

  • Trophozoïtes de Pneumocystis jirovecii

  • Certaines bactéries intracellulaires

Coloration au trichrome (coloration de Gomori-Wheatley) et coloration par l'hématoxyline ferrique

Ces colorations sont utilisées pour détecter les protozoaires intestinaux.

La coloration de Gomori-Wheatley est utilisée pour détecter les microsporidies. La coloration de Gomori-Wheatley peut ne pas mettre en évidence les œufs et larves d'helminthes et ne permet pas une identification fiable de Cryptosporidium. Les champignons et les cellules humaines fixent le colorant.

La coloration par l'hématoxyline ferrique différencie les cellules, les inclusions cellulaires et les noyaux. Avec la coloration par l'hématoxyline ferrique, les œufs d'helminthes peuvent être colorés de manière trop foncée pour permettre leur identification.