L'examen microscopique des tissus peut être nécessaire pour distinguer la maladie invasive d'une colonisation de surface; une distinction qui n'est pas aisément obtenue par les cultures.
La plupart des prélèvements nécessitent une coloration qui met en évidence les microrganismes pathogènes; bien qu'un montage humide sous hydroxyde de potassium non coloré permette de détecter des champignons et d'autres pathogènes.
Le médecin choisit une coloration en fonction des microrganismes pathogènes potentiellement présents. Cependant, aucune coloration n'est spécifique à 100% (c'est-à-dire que différents microrganismes peuvent se colorer de la même façon). La plupart des prélèvements sont traités par coloration de Gram et, en cas de suspicion de mycobactéries, par coloration spécifique acido-résistante. Cependant, certains pathogènes ne sont pas bien visibles avec ces colorations; si de tels agents pathogènes sont suspectés, des méthodes différentes d'identification ou de coloration sont nécessaires.
La détection par microscope nécessite habituellement une concentration d'agent d'environ au moins 1 × 104-5/mL, la plupart des liquides biologiques (p. ex., le liquide céphalorachidien) sont concentrés (p. ex., par centrifugation) avant l'examen.
La microscopie optique peut être réalisée rapidement, mais sa précision dépend de l'expérience du microscopiste et de la qualité de l'équipement. La réglementation réserve souvent l'utilisation du microscope à visée diagnostique aux laboratoires agréés.
Coloration de Gram
La coloration de Gram fait ce qui suit:
Classe les bactéries selon leur capacité à retenir la coloration par le cristal violet (Gram positif, couleur bleue) ou non (Gram négatif, couleur rouge)
Permet l'étude de la morphologie de la cellule (p. ex., bacilles ou cocci) et du type de regroupement (p. ex., amas, chaînettes, diploïdes)
Identifie les leucocytes polynucléaires, ce qui est en faveur d'une infection plutôt que d'une colonisation bactérienne
Ces caractéristiques peuvent orienter le traitement antibiotique en attendant l'identification définitive. Trouver un mélange de microrganismes avec de multiples morphologies et caractéristiques de coloration au Gram évoque un échantillon contaminé ou une infection bactérienne polymicrobienne. La découverte de nombreuses cellules malpighiennes dans un prélèvement d'expectorations suggère que l'échantillon est contaminé par de la salive et est d'un intérêt diagnostique limité.
Pour effectuer une coloration de Gram, le prélèvement est fixé par la chaleur sur une lame de verre et coloré par exposition séquentielle au cristal violet de Gram, à l'iode, à un décolorant et à une coloration de contraste (en général de la safranine).
Colorations acido-résistante et acido-résistante modifiée
Ces colorations sont utilisées pour identifier les microrganismes suivants:
Microrganismes acido-résistants (Mycobacterium spp)
Microrganismes modérément acido-résistants (principalement Nocardia spp)
Rhodococcus et genres apparentés
Oocystes de certains parasites (p. ex., Cryptosporidium, microsporidia, Cystoisospora [Isospora] belli, Cyclospora, Balantidium coli)
Bien que la détection des mycobactéries dans les crachats requière au moins 10 000 microrganismes/mL, les mycobactéries sont souvent présentes à des taux moins élevés et la sensibilité du test est donc limitée. Habituellement, plusieurs mL d'expectorations sont décontaminés avec de l'hydroxyde de sodium (soude caustique) et concentrés par centrifugation en vue d'une coloration acido-résistante. Sa spécificité est en revanche meilleure, bien que certains microrganismes modérément acido-résistants soient difficiles à distinguer des mycobactéries.
Colorations fluorescentes
Les colorations fluorescentes permettent une détection de souches à des concentrations plus faibles (< 1 × 104 cellules/mL). Les exemples en sont
Acridine orange (bactéries et champignons)
Auramine-rhodamine et auramine O (mycobactéries)
Calcofluor blanc (champignons, en particulier dermatophytes)
Le couplage d'un marqueur fluorescent à un anticorps spécifique d'un pathogène (immunofluorescence directe ou indirecte) doit en théorie permettre d'augmenter la sensibilité et la spécificité du test. Ces tests sont cependant difficiles à lire et à interpréter et peu d'entre eux (p. ex., tests par anticorps fluorescents directs pour Pneumocystis et Legionella) sont disponibles dans le commerce ou utilisés en routine.
Montages humides
Des montages humides de prélèvements non colorés peuvent être utilisés pour détecter les éléments suivants par microscopie à fond noir:
Les parasites (dont les œufs d'helminthes et les larves)
Cellules vaginales à inclusions (présentes dans la vaginose bactérienne)
Microrganismes mobiles (p. ex., Trichomonas)
Spirochètes Treponema (présents dans la syphilis)
La mise en évidence des champignons peut être accrue par l'application d'hydroxyde de potassium à 10% (KOH) pour dissoudre les tissus environnants et les microrganismes non fongiques.
Coloration à l'encre de Chine
L'encre de Chine (carbone colloïdal) est utilisée principalement pour détecter Cryptococcus neoformans ou d'autres champignons encapsulés dans une suspension cellulaire (p. ex., culot de sédimentation du liquide céphalorachidien). Le fond, et non le microrganisme lui-même, est coloré, ce qui révèle la capsule sous forme d'un halo. Dans le liquide céphalorachidien, ce test n'est pas aussi sensible que la recherche d'antigènes solubles cryptococciques. La spécificité est également limitée; les leucocytes peuvent apparaître encapsulés.
Coloration de Warthin-Starry et de Dieterle
Ces colorations couleur argent sont utilisées pour visualiser des bactéries telles que
Bartonella henselae (la cause de la maladie des griffes du chat)
Coloration de Wright et de Giemsa
Ces colorations sont utilisées pour détecter ce qui suit:
Parasites dans le sang
Histoplasma capsulatum dans les phagocytes et les cellules tissulaires
Inclusions intracellulaires formées par les virus et les infections à chlamydia
Trophozoïtes de Pneumocystis jirovecii
Certaines bactéries intracellulaires
Coloration au trichrome (coloration de Gomori-Wheatley) et coloration par l'hématoxyline ferrique
Ces colorations sont utilisées pour détecter les protozoaires intestinaux.
La coloration de Gomori-Wheatley est utilisée pour détecter les microsporidies. La coloration de Gomori-Wheatley peut ne pas mettre en évidence les œufs et larves d'helminthes et ne permet pas une identification fiable de Cryptosporidium. Les champignons et les cellules humaines fixent le colorant.
La coloration par l'hématoxyline ferrique différencie les cellules, les inclusions cellulaires et les noyaux. Avec la coloration par l'hématoxyline ferrique, les œufs d'helminthes peuvent être colorés de manière trop foncée pour permettre leur identification.
